De ontdekking van de α-helix en de β-sheet, de belangrijkste structuurkenmerken van eiwitten

Abstract

NPNAS-publicaties van Linus Pauling, Robert Corey en Herman Branson in het voorjaar van 1951 bevatten voorstellen voor de α-helix en de β-sheet, waarvan nu bekend is dat ze de ruggengraat vormen van tienduizenden eiwitten. Zij leidden deze fundamentele bouwstenen af uit eigenschappen van kleine moleculen, bekend uit zowel kristalstructuren als uit Pauling’s resonantietheorie van chemische binding die vlakke peptidegroepen voorspelde. Eerdere pogingen van anderen om modellen te bouwen voor eiwit schroeflijnen hadden gefaald, zowel door niet-vlakke peptiden op te nemen als door vast te houden aan schroeflijnen met een integraal aantal eenheden per draaiing. In belangrijke opzichten waren de Pauling-Corey-Branson modellen verbazingwekkend correct, met bindingslengtes die in 40 jaar niet in nauwkeurigheid waren overtroffen >. Zij hielden echter geen rekening met de hand van de helix of de mogelijkheid van gebogen vellen. Zij stelden ook structuren en functies voor die niet zijn gevonden, waaronder de γ-helix.

Een decennium voordat de structuren van complete eiwitten voor het eerst werden onthuld door röntgen-kristallografie, leidden Linus Pauling en Robert Corey van het California Institute of Technology (Fig. 1) de twee belangrijkste structurele kenmerken van eiwitten af: de α-helix en de β-sheet, waarvan nu bekend is dat zij de ruggengraten vormen van tienduizenden eiwitten. Hun conclusies, triomfen in het bouwen van modellen van grote moleculen op basis van kenmerken van kleinere moleculen, werden gepubliceerd in een reeks van acht artikelen, meegedeeld aan PNAS in februari en maart 1951. Hun werk had een betekenis voor eiwitten die vergelijkbaar was met die van het Watson-Crick-paper voor DNA twee jaar later, waarin de modelbouwbenadering van Pauling-Corey werd toegepast. Ik vat hier de hoofdpunten van deze historische artikelen samen, en noem dan enkele verrassende omissies daarin.

iv xmlns:xhtml=”http://www.w3.org/1999/xhtml Fig. 1.

Linus Pauling en Robert Corey (A) en Herman Branson (B). Pauling’s diepgaande kennis van chemische structuur en binding, zijn geheugen voor details en zijn creatieve flair waren allemaal factoren in de ontdekking van de α-helix. Robert Corey was een waardige en verlegen röntgenkristallograaf met de know-how en het geduld om moeilijke structuren uit te werken, waardoor Pauling de fundamentele informatie kreeg die hij nodig had. Herman Branson was een natuurkundige met verlof aan het California Institute of Technology, die van Pauling de opdracht had gekregen om alle helices te vinden die in overeenstemming waren met de regels van de structuurchemie die hij en Corey hadden vastgesteld. De houten helix tussen Pauling en Corey heeft een schaal van 1 inch per Å, een vergroting van 254.000.000 keer. (A) Met dank aan de Archives, California Institute of Technology. (B) Courtesy of the Lincoln University of Pennsylvania Archives.

Het meest revolutionaire van deze artikelen is het eerste, ingediend bij PNAS op Pauling’s 50ste verjaardag, 28 februari 1951. Het is The Structure of Proteins: Two Hydrogen-Bonded Helical Configurations of the Polypeptide Chain (1), waarin Pauling en Corey worden vergezeld door een derde coauteur, H.R. Branson, een Afro-Amerikaanse natuurkundige, die op dat moment met verlof was van zijn faculteitspositie aan de Howard University (Fig. 1). In de openingsalinea stellen de auteurs dat “we het probleem van de structuur van proteïnen op verschillende manieren hebben aangepakt. Een van deze manieren is de volledige en nauwkeurige bepaling van de kristalstructuur van aminozuren, peptiden en andere eenvoudige substanties die verwant zijn aan proteïnen, zodat informatie over interatomaire afstanden, bindingshoeken en andere configuratieparameters kan worden verkregen die de betrouwbare voorspelling van redelijke configuraties van de polypeptideketen mogelijk zou maken.” Met andere woorden, de structuurchemicus Pauling geloofde dat hij met een nauwkeurige onderdelenlijst voor eiwitten in de hand in staat zou zijn om belangrijke aspecten van hun algemene architectuur af te leiden, en dit bleek ook zo te zijn.

De volgende twee alinea’s zetten de methode beknopt uiteen: “Het probleem dat wij onszelf hebben gesteld is dat van het vinden van alle waterstof-gebonden structuren voor een enkele polypeptideketen, waarin de residuen equivalent zijn (met uitzondering van de verschillen in de zijketen R).” Dat wil zeggen, de auteurs zochten naar alle mogelijke herhalende structuren (schroeflijnen) waarin de carbonyl CEmbedded ImageO groep van elk aminozuur residu een N-H waterstofbrug accepteert van een ander residu. Waarom geloofden zij dat er slechts een klein aantal soorten schroeflijnen zou zijn? Dit kwam door de beperkingen die aan de structuur werden gesteld door de precieze bindingslengtes en bindingshoeken die zij hadden gevonden bij hun eerdere studies van kristalstructuren van aminozuren en peptiden, de componenten waaruit eiwitten zijn opgebouwd. Deze beperkingen worden samengevat in de derde paragraaf van hun artikel, waarin de bindingslengtes en -hoeken die zij hadden gevonden tot drie significante cijfers worden gespecificeerd.† De belangrijkste beperking was dat alle zes atomen van de amide (of peptide) groep, die elk aminozuur residu verbindt met het volgende in de eiwitketen, in een enkel vlak liggen. Pauling had vlakke peptidegroepen voorspeld vanwege resonantie van elektronen tussen de dubbele binding van de carbonylgroep en de amide C-N binding van de peptidegroep (Schema 1).

Schema 1.

In feite waren dergelijke vlakke peptidegroepen waargenomen in de kristalstructuren van N-acetylglycine en β-glycylglycine. De auteurs stellen het zo: “Dit structurele kenmerk is geverifieerd voor elk van de amiden die wij hebben bestudeerd. Bovendien is de resonantietheorie nu zo goed onderbouwd en de experimentele onderbouwing zo uitgebreid, dat er geen enkele twijfel kan bestaan over de toepassing ervan op de amidegroep.”

Toen Pauling, Corey en Branson schroeflijnen construeerden met vlakke amidegroepen, met de exacte bindingsafmetingen die zij in kristalstructuren hadden waargenomen, en met lineaire waterstofbruggen met een lengte van 2,72 Å, ontdekten zij dat er slechts twee mogelijkheden waren. Deze twee noemden zij de helix met 3,7 residuen per draai en de helix met 5,1 residuen per draai (Fig. 2), die al snel de α-helix en de γ-helix werden genoemd.

Fig. 2.

De α-helix (links) en de γ-helix (rechts), zoals afgebeeld in het artikel van Pauling, Corey, en Branson uit 1951 (1). Biochemici zullen opmerken dat de CEmbedded ImageO groepen van de α-helix in de richting van zijn C-eindpunt wijzen, terwijl die van de γ-helix in de richting van zijn N-eindpunt wijzen, en verder, dat de afgebeelde α-helix linkshandig is en bestaat uit d-aminozuren. (Overgenomen met toestemming van Linda Pauling Kamb.)

Een groot deel van de rest van dit korte, briljante artikel wordt in beslag genomen door een vergelijking van deze twee schroeflijnen met schroeflijnen die eerder door anderen waren voorgesteld, met name door Bragg, Kendrew, en Perutz (2) in een artikel van het jaar daarvoor, dat een poging deed om alle mogelijke eiwit schroeflijnen op te sommen, maar deze twee miste. In hun α-helix artikel slaan Pauling et al. een toon aan van triomf: “Geen van deze auteurs stelt onze helix van 3,7 residu of onze helix van 5,1 residu voor. Aan de andere kant zouden wij door onze basispostulaten alle door hen voorgestelde structuren elimineren. De reden voor het verschil in resultaten verkregen door andere onderzoekers en door ons met in wezen gelijksoortige argumenten is dat zowel Bragg als zijn medewerkers… alleen spiraalvormige structuren met een integraal aantal residuen per draaiing in detail hebben besproken, en bovendien slechts uitgaan van een ruwe benadering van de eisen aangaande interatomaire afstanden bindingshoeken, en planariteit van de geconjugeerde amidegroep, zoals gegeven door ons onderzoek van eenvoudiger stoffen. Wij beweren dat deze stereochemische kenmerken zeer dicht bij elkaar moeten liggen in stabiele configuraties van polypeptideketens in eiwitten, en dat er geen speciale stabiliteit is verbonden aan een integraal aantal residuen per draaiing in het spiraalvormige molecuul”. Kortom, stereochemie is belangrijk bij het bepalen welke schroeflijnen mogelijk zijn, en integrale symmetrie speelt geen enkele rol.

Heden ten dage accepteren we zonder meer dat schroeflijnen geen integraal aantal monomere eenheden per draaiing hoeven te hebben. Maar in 1950 zadelden de kristallo-grafische achtergronden van Bragg, Kendrew en Perutz, drie van de grootste structuurwetenschappers van de 20e eeuw, hen op met de notie van integraal aantal eenheden per eenheidscel. Zij misten ook de noodzaak van planaire peptidegroepen. Werkend in de natuurkundige afdeling van de Universiteit van Cambridge (Cambridge, V.K.), waren zij zich niet bewust van conjugatie met nabijgelegen dubbele bindingen. De professor in organische scheikunde aan de Cambridge Universiteit in die tijd was Alexander Todd, die tegenover Bragg en zijn team op de binnenplaats werkte. Todd herinnerde zich (3) dat “ondanks de nabijheid Bragg, voor zover ik weet, nooit een voet in het chemisch laboratorium had gezet… totdat hij op een dag… in een wat opgewonden gemoedstoestand naar mijn kamer kwam, met een stapel papieren in zijn hand,” waaronder het Pauling-Corey-Branson artikel en zijn eigen artikel over schroefhelften. Bragg vroeg Todd of hij de α-helix prefereerde boven de helices die Bragg en zijn collega’s hadden uitgevonden. Todd antwoordde: “Ik denk dat, gegeven het bewijsmateriaal, iedere organisch chemicus Pauling’s opvatting zou accepteren. Inderdaad, als u op enig moment sinds ik in Cambridge ben, naar het chemisch laboratorium was gekomen, dan… zou ik u dat verteld hebben.”

Het idee van de niet-integrale α-helix was drie jaar eerder bij Pauling opgekomen, toen hij gasthoogleraar was aan de Universiteit van Oxford. Hij werd verkouden door het vochtige weer en lag enkele dagen in bed. Hij herinnerde zich (4) dat hij zich al snel verveelde met detectiveromans en “Ik had geen moleculaire modellen bij me in Oxford, maar ik nam een vel papier en schetste de atomen met de bindingen ertussen en vouwde dan het papier om de ene binding in de juiste hoek te buigen, wat ik dacht dat het moest zijn ten opzichte van de andere, en bleef dit doen, een helix makend, totdat ik waterstofbruggen kon vormen tussen de ene draai van de helix en de volgende draai van de helix, en het kostte maar een paar uur om dat te doen om de α-helix te ontdekken.”

Waarom heeft Pauling drie jaar gewacht met het publiceren van deze ontdekking, die hij in slechts een paar uur had gedaan? Hij gaf het antwoord in zijn banketrede op het derde symposium van de Protein Society in Seattle in 1989. Hij voelde zich ongemakkelijk over het feit dat het diffractiepatroon van α-keratine als belangrijkste meridionale kenmerk een sterke reflectie vertoont met een resolutie van 5,15Å, terwijl de herhaling van de α-helix, berekend uit zijn modellen met Corey, op 5,4 Å lag. Zoals hij zegt in zijn vierde paper van de PNAS-reeks met Corey: “De boog van 5,15Å lijkt op het eerste gezicht de α-helix uit te sluiten, waarvoor de c-as periode een veelvoud moet zijn van de asafstand per draai…”. Maar toen kwam het artikel in 1950 van Bragg, Kendrew, en Perutz met een opsomming van mogelijke eiwit helices. Pauling vertelde zijn publiek in 1989: “Ik wist dat als ze met alle verkeerde schroeflijnen op de proppen konden komen, ze snel met de juiste zouden komen, dus ik voelde de behoefte om het te publiceren.”

De oorsprong van de discrepantie tussen de herhaling van de α-helix en de röntgenreflectie van α-keratine werd een jaar later gevonden door Francis Crick (5), toen een afgestudeerde student bij Perutz, en ook door Pauling. Het is dat keratine een spiraal is, met α-helixen die zich om elkaar heen winden. De bredere excursie van de α-helix in de spiraal reduceert zijn herhaalafstand tot 5.1 Å. Deze vaardigheid om te weten welk tegenstrijdig feit te negeren was een van Pauling’s grote talenten als creatief wetenschapper.

The β-Sheets

Het tweede artikel van de serie verscheen als een van een groep van zeven in een enkel nummer van PNAS. Het was: The Pleated Sheet, A New Layer Configuration of Polypeptide Chains (6). In dit artikel melden Pauling en Corey dat zij een waterstofgebonden laagconfiguratie van polypeptideketens hebben ontdekt, waarbij de vlakke peptidegroepen in het vlak van de plaat liggen, en opeenvolgende eiwitketens in tegengestelde richtingen kunnen lopen, waardoor een antiparallelle plaat ontstaat, evenals een parallelle plaat. In beide gevallen worden opnieuw lineaire H-bindingen gevormd, maar dan tussen eiwitketens in plaats van binnen een enkele keten. Dit resulteert in eiwitketens die niet volledig verlengd zijn: de toename per residu is 3,3 Å, een afstand die wordt gezien in röntgendiffractiepatronen van β-keratine, in plaats van 3,6 Å, die verwacht wordt voor een volledig verlengde eiwitketen.

Bevestiging van het α-helix en β-Sheet model

De bevestiging van de α-helix kwam van Max Perutz, een van de drie auteurs van het artikel uit 1950 dat de verkeerde helices had opgesomd. Op een zaterdagochtend in het voorjaar van 1951, kwam hij het PNAS artikel tegen (7). “Ik was overdonderd door het artikel van Pauling en Corey. In tegenstelling tot Kendrew’s en mijn helices, was die van hen vrij van spanning; alle amide groepen waren planair en elke carbonylgroep vormde een perfecte waterstofbrug met een iminogroep vier residuen verder in de keten. De structuur leek helemaal juist. Hoe kon ik het gemist hebben?… Ik fietste naar huis om te lunchen en at het op, niet wetend wat mijn kinderen kletsten en niet reagerend op de vragen van mijn vrouw wat er vandaag met me aan de hand was.”

Opeens kreeg Perutz een idee: “De α-helix van Pauling en Corey was als een wenteltrap waarin de aminozuurresiduen de treden vormden en de hoogte van elke trede 1,5 Å bedroeg.5 Å. Volgens de diffractietheorie zou deze regelmatige herhaling moeten leiden tot een sterke röntgenreflectie met een tussenruimte van 1,5 Å van vlakken die loodrecht op de vezelas staan… In uitzinnige opwinding fietste ik terug naar het lab en zocht een paardenhaar dat ik in een lade had opgeborgen…” en legde het in de röntgenbundel onder een hoek van 31° ten opzichte van de bundel om de 1,5-Å herhaling in de reflecterende positie te brengen. “Na een paar uur ontwikkelde ik de film, met mijn hart in mijn keel. Zodra ik het licht aan deed, vond ik een sterke reflectie op 1,5-Å-afstand, precies zoals de α-helix van Pauling en Corey eiste.”

Op maandagochtend liet Perutz zijn röntgendiffractiefoto aan Bragg zien. “Toen hij me vroeg wat me op het idee bracht van dit cruciale experiment, vertelde ik hem dat het idee was ontstaan uit mijn woede over het feit dat ik de bouw van die prachtige structuur zelf had gemist. Braggs snelle antwoord was: ‘Ik wou dat ik je eerder boos had gemaakt!’ want de ontdekking van de 1,5-Å reflectie zou ons rechtstreeks naar de α-helix hebben geleid.” Perutz vond ook de 1.5-Å reflectie in diffractie van hemoglobine. Hij schreef aan Pauling (8): “De vervulling van deze voorspelling en, tenslotte, de ontdekking van deze reflectie in hemoglobine is de meest opwindende ontdekking van mijn leven geweest.” Perutz, samen met zijn collega’s Dickerson, Kendrew, Strandberg, en Davies, zou later nog meer spannende ontdekkingen doen, waaronder het zien van directe foto’s van α-helixen in myoglobine en hemoglobine.

β-Sheets en enkelstrengs β-ribbons werden voor het eerst gezien in bolvormige eiwitten zoals in de structuur van eiwit lysozym in 1965 (9). Een eerste verrassing was dat zowel de strengen als de vellen gedraaid zijn, in tegenstelling tot de rechte strengen en geplooide vellen van Pauling en Corey. In 1989 herinnerde Pauling zich dat zodra hij de structuur van lysozym met de gedraaide plaatjes zag, hij zich realiseerde dat hij de draaiing in het oorspronkelijke model had moeten opnemen. Recenter zijn er grondige analyses gemaakt van twist en afschuiving in β-structuren (10, 11).

Enkele verrassende omissies uit de 1951 Papers

Chemisten die de α-helix van Fig. 2 zorgvuldig bekijken zullen twee verrassende kenmerken opmerken: (i) Het is een linkshandige helix, in tegenstelling tot α-helixen van biologische eiwitten, waarvan nu bekend is dat ze rechtshandig zijn. Dat wil zeggen, als je linkerduim langs de helix-as wijst, draait de helix in de richting van de vingers van je linkerhand. (ii) De configuratie van chemische groepen rond elk α-koolstofatoom heeft de d-configuratie, in plaats van de natuurlijk voorkomende l-configuratie van aminozuurresiduen in eiwitten. Dat wil zeggen, dit model van Pauling et al. is het spiegelbeeld van een α-helix in een natuurlijk eiwit. De γ-helix in Fig. 2 is daarentegen een rechtshandige helix die is opgebouwd uit d-aminozuurresiduen. Waarom kozen de auteurs ervoor om de α-helix als linkshandig te tekenen, met d-aminozuren?

De basis voor deze keuze is onlangs geanalyseerd door Dunitz (12), die ten tijde van het Pauling-Corey onderzoek een postdoctoraal fellow was aan het California Institute of Technology. In feite was het Dunitz die Pauling overhaalde om zijn terminologie te veranderen van “spiraal” in “helix” bij het beschrijven van de nieuwe eiwitstructuren. In zijn analyse merkt Dunitz op dat 1951, het jaar van de α-helix, ook het jaar was waarin J.M. Bijvoet de absolute configuratie van moleculen vaststelde door de abnormale verstrooiing van x-stralen. Na herinneringen aan discussies over overhandigheid aan het California Institute of Technology in dat jaar, concludeert Dunitz: “Ofwel Pauling was niet op de hoogte van deze ontwikkelingen toen hij het α-helix artikel schreef, ofwel hij wist ervan maar was ongeïnteresseerd…. Ik ben geneigd te geloven dat Pauling (of zijn collega Robert B. Corey), toen zij het artikel schreven, of heel misschien zelfs toen zij de modellen maakten, gewoon een van de twee aminozuurconfiguraties koos (toevallig de verkeerde) om de spiraalvormige structuren te illustreren en niet veel nadacht over het probleem van de absolute configuratie… Problemen van absolute configuratie kregen weinig of geen aandacht omdat er toen geen noodzaak voor leek te bestaan. Misschien beschouwde men ze zelfs als een afleiding van de eigenlijke taak. Soms kan men zich beter concentreren door één oog te sluiten.”

Ook ontbreekt in het eerste artikel een meer dan terloopse vermelding van de 310-helix, een onderdeel van bolvormige eiwitten dat zelden in korte segmenten voorkomt, maar vaker dan de Pauling-Corey-Branson γ-helix, die vrijwel nooit wordt gezien. De H-bindingen van de 310 helix zijn iets te lang en gebogen om aanvaardbaar te zijn voor de strenge drempels die de auteurs hebben vastgesteld. Hun intuïtie over gebogen en lange waterstofbruggen die structuren destabiliseren was in principe juist, maar de drempels die zij stelden zijn strenger dan de drempels die tegenwoordig worden gebruikt (13), nu we weten dat de natuur de 310 helix accepteert.

Een andere omissie in de reeks van 1951 artikelen is het Ramachandran diagram. Dit is een 2D-plot van de toegestane waarden van rotatie om de N-Cα en Cα-CEmbedded ImageO bindingen in de eiwit-backbone, geïntroduceerd door Ramachandran en anderen in 1964 (14). Dit diagram laat zien dat de meeste waarden van rotatie om deze twee bindingen verboden zijn door botsingen van eiwitatomen. Slechts twee grote gebieden van het diagram zijn toegestaan: één komt overeen met de α-helix, en één met de bijna verlengde ketens van de β-sheets. Tegenwoordig wordt het Ramachandran-diagram onderwezen in alle klassen over eiwitstructuur en komt het in elk leerboek voor om inzicht te geven in de krachten die de structuren van eiwitten bepalen. Maar er staat niets in dit diagram buiten wat Pauling en Corey goed wisten: zij bouwden modellen van hun voorgestelde structuren die alle kenmerken van het Ramachandran-diagram belichaamden. Blijkbaar begrepen zij de principes zo goed dat zij het niet nodig achtten deze met een dergelijk diagram uit te leggen. Een andere factor kan zijn geweest dat Pauling en Corey zich meer concentreerden op de stabiliteit die wordt geboden door waterstofbruggen en minder op de beperkingen van mogelijke structuren die worden opgelegd door botsingen tussen atomen zonder binding.

De andere zes PNAS artikelen van Pauling en Corey en de bredere context

De resterende zes artikelen in PNAS geven de atoomcoördinaten van de modellen en interpreteren de diffractiepatronen van vezelige eiwitten in termen van de modellen. Er staat veel in deze artikelen dat niet is uitgekomen, waaronder een voorstel dat spiercontractie een overgang is van verlengde β-strengen naar compacte α-helften. Niettemin overschaduwen de adembenemende juistheid van de α-helix en de β-sheets en de gedurfde benadering van het modelleren van biologische structuren vanuit chemische principes de rest.

Deze papers zijn des te opmerkelijker als we de politieke context in ogenschouw nemen waarin ze werden geschreven. In deze periode was Pauling ook sterk betrokken bij de verdediging van academici, waaronder hijzelf, tegen beschuldigingen van ontrouw aan de Verenigde Staten, veroorzaakt door de druk van de Koude Oorlog en wat bekend werd als McCarthyisme. Hij werd gedagvaard om voor verschillende anticommunistische onderzoekscommissies te verschijnen, hij ontving haatmail voor zijn werk voor liberale doelen, en hij kreeg te maken met de opzegging van zijn belangrijke consultingcontract en met koelbloedigheid van sommige collega’s van het California Institute of Technology. Op de dag nadat Pauling en Corey hun zeven proteïnepapers ter publicatie hadden ingediend, noemde het House Un-American Activities Committee Pauling een van de belangrijkste Amerikanen die betrokken waren bij een “Campaign to Disarm and Defeat the United States” (8). In het persbericht stond: “Zijn hele staat van dienst… geeft aan dat Dr. Linus Pauling zich in de eerste plaats bezighoudt met het in dienst stellen van zijn wetenschappelijke prestaties van een groot aantal organisaties die hun volledige onderdanigheid aan de Communistische Partij van de VS en de Sovjet Unie gemeen hebben”. Op de een of andere manier kon Pauling, zelfs in het aangezicht van zulke valse beschimpingen en meervoudige afleidingen, zijn focus als een creatieve topwetenschapper behouden.

Acknowledgments

Ik dank David R. Davies, Richard E. Dickerson, Jack Dunitz, Richard E. Marsh, en Doug Rees voor discussie.

Footnotes

  • ↵* E-mail: david{at}mbi.ucla.edu.

  • Dit perspectief is gepubliceerd als onderdeel van een serie waarin de nadruk wordt gelegd op historische artikelen die in PNAS zijn gepubliceerd. Lees meer over dit klassieke PNAS-artikel online op www.pnas.org/misc/classics.shtml.

  • ↵† De bindingslengtes liggen allemaal binnen 1 standaardafwijking van die welke 40 jaar later zijn bepaald (15).

Geef een reactie

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd. Vereiste velden zijn gemarkeerd met *