La scoperta dell’α-elica e del foglio β, le principali caratteristiche strutturali delle proteine

Abstract

I documenti dellaPNAS di Linus Pauling, Robert Corey e Herman Branson nella primavera del 1951 proposero l’α-elica e il foglio β, ora conosciuti per formare le colonne portanti di decine di migliaia di proteine. Hanno dedotto questi elementi fondamentali dalle proprietà delle piccole molecole, conosciute sia dalle strutture dei cristalli che dalla teoria di risonanza di Pauling del legame chimico che prevedeva gruppi peptidici planari. I precedenti tentativi di altri di costruire modelli per le eliche proteiche erano falliti sia includendo peptidi non planari sia insistendo su eliche con un numero integrale di unità per giro. Nei principali aspetti, i modelli Pauling-Corey-Branson erano sorprendentemente corretti, includendo lunghezze di legame che non sono state superate in accuratezza per >40 anni. Tuttavia, non consideravano la mano dell’elica o la possibilità di fogli piegati. Hanno anche proposto strutture e funzioni che non sono state trovate, compresa la γ-elica.

Un decennio prima che le strutture di intere proteine fossero rivelate per la prima volta dalla cristallografia a raggi X, Linus Pauling e Robert Corey del California Institute of Technology (Fig. 1) dedussero le due principali caratteristiche strutturali delle proteine: l’α-elica e il foglio β, ora noti per formare le ossa portanti di decine di migliaia di proteine. Le loro deduzioni, trionfi nella costruzione di modelli di grandi molecole basati su caratteristiche di molecole più piccole, furono pubblicate in una serie di otto articoli, comunicati a PNAS nel febbraio e marzo 1951. Il loro lavoro ha avuto un significato per le proteine paragonabile a quello di 2 anni dopo della carta di Watson-Crick per il DNA, che ha adottato l’approccio di costruzione di modelli di Pauling-Corey. Qui riassumo i punti principali di questi articoli storici, e poi menziono alcune omissioni sorprendenti da essi.

iv xmlns:xhtml=”http://www.w3.org/1999/xhtml Fig. 1.

Linus Pauling e Robert Corey (A) e Herman Branson (B). La profonda comprensione di Pauling della struttura chimica e dei legami, la sua memoria ritentiva per i dettagli e il suo estro creativo furono tutti fattori nella scoperta dell’α-elica. Robert Corey era un dignitoso e timido cristallografo a raggi X con il know-how e la pazienza di elaborare strutture difficili, fornendo a Pauling le informazioni fondamentali di cui aveva bisogno. Herman Branson era un fisico in congedo al California Institute of Technology, che fu diretto da Pauling a trovare tutte le eliche coerenti con le regole della chimica strutturale che lui e Corey avevano determinato. L’elica di legno tra Pauling e Corey ha una scala di 1 pollice per Å, un ingrandimento di 254.000.000 di volte. (A) Per gentile concessione degli archivi del California Institute of Technology. (B) Per gentile concessione degli archivi della Lincoln University of Pennsylvania.

Il più rivoluzionario di questi articoli è il primo, presentato a PNAS il 28 febbraio 1951, giorno del 50° compleanno di Pauling. È La struttura delle proteine: Two Hydrogen-Bonded Helical Configurations of the Polypeptide Chain (1), in cui Pauling e Corey sono affiancati da un terzo coautore, H. R. Branson, un fisico afro-americano, allora in congedo dalla sua posizione di facoltà alla Howard University (Fig. 1). Nel paragrafo di apertura, gli autori affermano che “abbiamo attaccato il problema della struttura delle proteine in diversi modi. Uno di questi modi è la determinazione completa e accurata della struttura cristallina degli aminoacidi, dei peptidi e di altre sostanze semplici legate alle proteine, in modo da ottenere informazioni sulle distanze interatomiche, gli angoli di legame e altri parametri configurazionali che permetterebbero la previsione affidabile di configurazioni ragionevoli della catena polipeptidica”. In altre parole, il chimico strutturale Pauling credeva che con un accurato elenco di parti per le proteine in mano sarebbe stato in grado di dedurre i principali aspetti della loro architettura complessiva, e questo si è dimostrato essere così.

I due paragrafi successivi espongono concisamente il metodo: “Il problema che ci siamo posti è quello di trovare tutte le strutture con legami a idrogeno per una singola catena polipeptidica, in cui i residui sono equivalenti (tranne le differenze nella catena laterale R).” Cioè, gli autori hanno cercato tutte le possibili strutture ripetute (eliche) in cui il gruppo carbonilico CEmbedded ImageO di ogni residuo aminoacidico accetta un legame idrogeno N-H da un altro residuo. Perché credevano che ci sarebbe stato solo un piccolo numero di tipi di eliche? A causa dei vincoli sulla struttura imposti dalle lunghezze precise dei legami e dagli angoli di legame che avevano trovato dai loro studi passati sulle strutture cristalline degli aminoacidi e dei peptidi, i componenti da cui sono costruite le proteine. Questi vincoli sono riassunti nel terzo paragrafo del loro documento, che specifica con tre cifre significative le lunghezze e gli angoli di legame che avevano trovato.† Il vincolo più importante era che tutti i sei atomi del gruppo ammidico (o peptidico), che unisce ogni residuo di amminoacido al successivo nella catena proteica, si trovano in un unico piano. Pauling aveva previsto gruppi peptidici planari a causa della risonanza degli elettroni tra il doppio legame del gruppo carbonilico e il legame ammidico C-N del gruppo peptidico (Schema 1).

Schema 1.

In effetti, tali gruppi peptidici planari sono stati osservati nelle strutture cristalline della N-acetilglicina e della β-glicilglicina. Come hanno detto gli autori: “Questa caratteristica strutturale è stata verificata per ciascuna delle ammidi che abbiamo studiato. Inoltre, la teoria della risonanza è ora così ben fondata e la sua conferma sperimentale così estesa che non ci può essere alcun dubbio sulla sua applicazione al gruppo amidico.”

Quando Pauling, Corey e Branson costruirono delle eliche con gruppi amidici planari, con le precise dimensioni di legame che avevano osservato nelle strutture dei cristalli, e con legami idrogeno lineari di lunghezza 2,72 Å, trovarono che c’erano solo due possibilità. Queste due furono chiamate l’elica con 3,7 residui per giro e l’elica con 5,1 residui per giro (Fig. 2), presto chiamate α-elica e γ-elica.

Fig. 2.

L’α-elica (a sinistra) e la γ-elica (a destra), come raffigurato nel documento del 1951 di Pauling, Corey e Branson (1). I biochimici noteranno che i gruppi CEmbedded ImageO dell’α-elica puntano in direzione del suo terminale C, mentre quelli della γ-elica puntano verso il suo terminale N, e, inoltre, che l’α-elica mostrata è mancina e composta da d-amminoacidi. (Riprodotto con il permesso di Linda Pauling Kamb.)

Molto del resto di questo breve, brillante documento è occupato da un confronto di queste due eliche con le eliche proposte in precedenza da altri, in particolare Bragg, Kendrew, e Perutz (2) in un documento dell’anno precedente, che ha tentato di enumerare tutte le possibili eliche proteiche, ma ha mancato queste due. Nel loro articolo sull’α-elica, Pauling et al. assumono un tono di trionfo: “Nessuno di questi autori propone né la nostra elica di 3,7 residui né la nostra elica di 5,1 residui. D’altra parte, noi elimineremmo con i nostri postulati di base tutte le strutture proposte da loro. La ragione della differenza nei risultati ottenuti da altri ricercatori e da noi attraverso argomenti essenzialmente simili è che sia Bragg che i suoi collaboratori … hanno discusso in dettaglio solo strutture elicoidali con un numero integrale di residui per giro, e inoltre assumono solo un’approssimazione grossolana ai requisiti sulle distanze interatomiche, gli angoli di legame e la planarità del gruppo ammidico coniugato, come dato dalle nostre indagini su sostanze più semplici. Noi sosteniamo che queste caratteristiche stereochimiche devono essere mantenute molto strettamente nelle configurazioni stabili delle catene polipeptidiche nelle proteine, e che non c’è una stabilità speciale associata a un numero integrale di residui per giro nella molecola elicoidale”. In breve, la stereochimica è importante nel determinare quali eliche sono possibili, e la simmetria integrale non ha alcun ruolo.

Oggi, accettiamo senza pensarci due volte che le eliche non hanno bisogno di avere un numero integrale di unità monomeriche per giro. Ma nel 1950, il background cristallografico di Bragg, Kendrew e Perutz, tre dei più grandi scienziati strutturali del 20° secolo, li ha appesantiti con la nozione di numero integrale di unità per cella unitaria. Hanno anche mancato la necessità di gruppi peptidici planari. Lavorando nel dipartimento di fisica dell’Università di Cambridge (Cambridge, Regno Unito), non erano a conoscenza della coniugazione con doppi legami vicini. Il professore di chimica organica a Cambridge a quel tempo era Alexander Todd, che lavorava dall’altra parte del cortile di Bragg e del suo team. Todd ha ricordato (3) che “nonostante la vicinanza, Bragg non ha mai, che io sappia, messo piede nel laboratorio chimico … fino a quando un giorno … è venuto nella mia stanza in uno stato d’animo piuttosto agitato, portando un mucchio di documenti in mano”, tra cui il documento di Pauling-Corey-Branson e il suo sulle eliche. Bragg chiese a Todd se preferiva l’α-elica alle eliche che Bragg e i suoi colleghi avevano inventato. Todd rispose: “Penso che, data l’evidenza, qualsiasi chimico organico accetterebbe il punto di vista di Pauling. Infatti, se in qualsiasi momento da quando sono a Cambridge lei fosse venuto al laboratorio chimico, io… glielo avrei detto.”

L’idea dell’α-elica non integrale era venuta a Pauling 3 anni prima, quando era professore ospite all’Università di Oxford. Aveva preso freddo per il tempo umido e passò diversi giorni a letto. Ha ricordato (4) che si era presto annoiato con i romanzi polizieschi e “non avevo nessun modello molecolare con me a Oxford, ma ho preso un foglio di carta e ho disegnato gli atomi con i legami tra loro e poi ho piegato la carta per piegare un legame all’angolo giusto, quello che pensavo dovesse essere rispetto all’altro, e ho continuato a fare questo, facendo un’elica, fino a quando ho potuto formare legami idrogeno tra un giro dell’elica e il prossimo giro dell’elica, e ci sono volute solo poche ore di questo per scoprire l’α-elica.”

Perché Pauling ha ritardato 3 anni a pubblicare questa scoperta che gli è venuta in poche ore? Ha dato la risposta nel suo discorso al banchetto del terzo simposio della Protein Society a Seattle nel 1989. Era a disagio per il fatto che il modello di diffrazione dell’α-cheratina mostra come principale caratteristica meridiana una forte riflessione a 5,15 Å di risoluzione, mentre la ripetizione dell’α-elica calcolata dai suoi modelli con Corey era a 5,4 Å. Come dice nel suo quarto articolo della serie PNAS con Corey: “L’arco di 5,15 Å sembra a prima considerazione escludere l’α-elica, per la quale il periodo dell’asse c deve essere un multiplo della distanza dell’asse per giro …” Ma poi arrivò il documento del 1950 di Bragg, Kendrew e Perutz che enumerava le potenziali eliche proteiche. Pauling disse al suo pubblico nel 1989: “Sapevo che se fossero riusciti a trovare tutte le eliche sbagliate, avrebbero presto trovato quella giusta, così ho sentito il bisogno di pubblicarla”

L’origine della discrepanza tra la ripetizione dell’α-elica e la riflessione ai raggi X dell’α-cheratina fu individuata un anno dopo da Francis Crick (5), allora studente laureato con Perutz, e anche da Pauling. È che la cheratina è una spirale, con α-eliche che si avvolgono l’una sull’altra. L’escursione più ampia dell’α-elica nella spirale riduce la sua distanza di ripetizione a 5,1 Å. Questa abilità di sapere quale fatto contraddittorio ignorare era una delle grandi capacità di Pauling come scienziato creativo.

Le β-Schede

Il secondo articolo della serie apparve come uno di un gruppo di sette in un singolo numero di PNAS. Si trattava di: The Pleated Sheet, A New Layer Configuration of Polypeptide Chains (6). In questo articolo, Pauling e Corey riferiscono di aver scoperto una configurazione a strati con legami a idrogeno di catene polipeptidiche, in cui i gruppi peptidici planari si trovano nel piano del foglio, e le catene proteiche successive possono correre in direzioni opposte, dando un foglio antiparallelo, così come un foglio parallelo. In entrambi, si formano ancora legami H lineari, ma tra le catene proteiche piuttosto che all’interno di una singola catena. Questo risulta in catene proteiche che non sono completamente estese: l’aumento per residuo è di 3,3 Å, una spaziatura vista nei modelli di diffrazione a raggi X della β-cheratina, piuttosto che 3,6 Å, prevista per una catena proteica completamente estesa.

Conferma dei modelli α-elica e β-foglio

La conferma dell’α-elica venne da Max Perutz, uno dei tre autori dell’articolo del 1950 che aveva elencato le eliche sbagliate. Un sabato mattina della primavera 1951, si imbatté nell’articolo di PNAS (7). “Sono rimasto folgorato dall’articolo di Pauling e Corey. In contrasto con le eliche di Kendrew e le mie, le loro erano prive di tensioni; tutti i gruppi ammidici erano planari e ogni gruppo carbonilico formava un perfetto legame idrogeno con un gruppo imino quattro residui più avanti nella catena. La struttura sembrava perfetta. Come potevo non averla vista? Ho pedalato fino a casa per il pranzo e l’ho mangiato ignaro delle chiacchiere dei miei figli e senza rispondere alle domande di mia moglie su cosa mi succedeva oggi.”

Improvvisamente Perutz ha avuto un’idea: “L’α-elica di Pauling e Corey era come una scala a spirale in cui i residui di amminoacidi formavano i gradini e l’altezza di ogni gradino era 1. 5 Å.5 Å. Secondo la teoria della diffrazione, questa ripetizione regolare dovrebbe dare origine a una forte riflessione a raggi X di 1,5 Å di distanza dai piani perpendicolari all’asse della fibra… Nell’eccitazione folle, sono tornato in laboratorio e ho cercato un crine di cavallo che avevo tenuto nascosto in un cassetto…” e l’ho messo nel fascio di raggi X con un angolo di 31° rispetto al fascio per portare la ripetizione di 1,5 Å in posizione di riflessione. “Dopo un paio d’ore, ho sviluppato la pellicola con il cuore in gola. Non appena ho acceso la luce, ho trovato una forte riflessione alla spaziatura di 1.5-Å, esattamente come richiesto dall’α-elica di Pauling e Corey.”

Il lunedì mattina, Perutz ha mostrato la sua immagine di diffrazione dei raggi X a Bragg. “Quando mi chiese cosa mi avesse fatto pensare a questo esperimento cruciale, gli dissi che l’idea era scaturita dalla mia rabbia per non aver costruito io stesso quella bellissima struttura. La pronta risposta di Bragg fu: “Vorrei averti fatto arrabbiare prima!” perché la scoperta della riflessione di 1,5Å ci avrebbe portato direttamente all’α-elica”. Perutz trovò anche il riflesso 1,5-Å nella diffrazione dell’emoglobina. Scrisse a Pauling (8), “L’adempimento di questa previsione e, infine, la scoperta di questo riflesso nell’emoglobina è stata la scoperta più emozionante della mia vita”. Perutz, insieme ai suoi colleghi Dickerson, Kendrew, Strandberg e Davies, avrebbe fatto in seguito scoperte ancora più emozionanti, compresa la visione di immagini dirette di α-eliche nella mioglobina e nell’emoglobina.

I fogliβ e i nastri β a filo singolo furono visti per la prima volta nelle proteine globulari come nella struttura del lisozima dell’albume nel 1965 (9). Una sorpresa iniziale fu che sia i filamenti che i fogli sono contorti, a differenza dei filamenti dritti e dei fogli plissettati di Pauling e Corey. Nel 1989 Pauling ha ricordato che appena vide la struttura del lisozima con il suo foglio ritorto si rese conto che avrebbe dovuto incorporare la torsione nel modello originale. Più recentemente ci sono state analisi approfondite della torsione e del taglio nelle strutture β (10, 11).

Alcune omissioni sorprendenti dai documenti del 1951

I chimici che guardano attentamente l’α-elica di Fig. 2 noteranno due caratteristiche sorprendenti: (i) È un’elica mancina, a differenza delle α-eliche delle proteine biologiche, che sono ormai note per essere destre. Cioè, se il pollice sinistro punta lungo l’asse dell’elica, l’elica gira nella direzione delle dita della mano sinistra. (ii) La configurazione dei gruppi chimici intorno ad ogni atomo di carbonio α ha la configurazione d, piuttosto che la configurazione l naturale dei residui di amminoacidi nelle proteine. Cioè, questo modello di Pauling et al. è l’immagine speculare di una α-elica in una proteina naturale. Al contrario, la γ-elica in Fig. 2 è un’elica destrorsa composta da residui di d-amminoacidi. Perché gli autori hanno scelto di disegnare l’α-elica come sinistrorsa, con residui di d-amminoacidi?

La base di questa scelta è stata recentemente analizzata da Dunitz (12), che era stato un borsista post-dottorato al California Institute of Technology al tempo della ricerca Pauling-Corey. Infatti, fu Dunitz che convinse Pauling a cambiare la sua terminologia da “spirale” a “elica” nella descrizione delle nuove strutture proteiche. Nella sua analisi, Dunitz nota che il 1951, l’anno dell’α-elica, fu anche l’anno in cui J. M. Bijvoet stabilì la configurazione assoluta delle molecole attraverso la diffusione anomala dei raggi X. Dopo aver ricordato le discussioni sull’handedness al California Institute of Technology in quell’anno, Dunitz conclude: “O Pauling non era a conoscenza di questi sviluppi quando scrisse l’articolo sull’α-elica, o li conosceva ma era disinteressato… Tendo a credere che quando scrissero l’articolo, o molto probabilmente anche quando realizzarono i modelli, Pauling (o il suo collega Robert B. Corey) semplicemente scelsero una delle due configurazioni di aminoacidi (come è successo, quella sbagliata) per illustrare le strutture elicoidali e non diedero molto peso al problema della configurazione assoluta… I problemi di configurazione assoluta ricevettero poca o nessuna attenzione, perché allora non sembrava che ce ne fosse bisogno. Forse erano addirittura considerati una distrazione dal compito da svolgere. A volte si può mettere a fuoco più chiaramente chiudendo un occhio.”

Nel primo documento manca anche qualcosa di più di una semplice menzione dell’elica 310, un componente delle proteine globulari che si trova raramente in brevi segmenti, ma più comune della γ-elica di Pauling-Corey-Branson, che non si vede praticamente mai. I legami H dell’elica 310 sono un po’ troppo lunghi e piegati per essere accettabili dalle soglie rigorose stabilite dagli autori. La loro intuizione sui legami a idrogeno piegati e lunghi che destabilizzano le strutture era fondamentalmente corretta, ma le soglie che avevano fissato sono più severe di quelle usate oggi (13), ora che sappiamo che la natura accetta l’elica 310.

Un’altra omissione dalla serie di documenti del 1951 è il diagramma di Ramachandran. Si tratta di un grafico 2D dei valori consentiti di rotazione intorno ai legami N-Cα e Cα-CEmbedded ImageO nella spina dorsale delle proteine, introdotto da Ramachandran e altri nel 1964 (14). Questo diagramma mostra che la maggior parte dei valori di rotazione intorno a questi due legami sono proibiti dalle collisioni degli atomi della proteina. Solo due grandi regioni del diagramma sono permesse: una corrisponde all’α-elica, e una alle catene quasi estese dei fogli β. Oggi il diagramma di Ramachandran è insegnato in tutte le classi sulla struttura delle proteine ed è presente in ogni libro di testo per dare un’idea delle forze che determinano le strutture delle proteine. Ma non c’è nulla in questo diagramma oltre a ciò che Pauling e Corey sapevano bene: hanno costruito modelli delle loro strutture proposte che incarnavano tutte le caratteristiche del diagramma di Ramachandran. Apparentemente avevano capito così bene i principi che non sentivano il bisogno di spiegarli con un diagramma di questo tipo. Un altro fattore può essere stato che Pauling e Corey si sono concentrati più sulla stabilità fornita dai legami a idrogeno e meno sulle restrizioni alle possibili strutture dettate dalle collisioni tra atomi non legati.

Gli altri sei articoli PNAS di Pauling e Corey e il contesto più ampio

I restanti sei articoli in PNAS danno le coordinate atomiche dei modelli e interpretano i modelli di diffrazione delle proteine fibrose in termini di modelli. C’è molto in questi articoli che non è stato confermato, compresa la proposta che la contrazione muscolare è una transizione da β-fili estesi a α-eliche compatte. Tuttavia, la correttezza mozzafiato dell’α-elica e dei fogli β e l’approccio audace di modellare le strutture biologiche dai principi chimici mettono in ombra il resto.

Questi documenti sono ancora più notevoli se si considera il contesto politico in cui sono stati scritti. Durante questo periodo, Pauling fu anche pesantemente coinvolto nella difesa degli accademici, incluso se stesso, dalle accuse di slealtà verso gli Stati Uniti, causate dalle pressioni della guerra fredda e da quello che divenne noto come maccartismo. Fu citato in giudizio per comparire davanti a varie commissioni investigative anticomuniste, ricevette lettere di odio per il suo lavoro sulle cause liberali, e dovette affrontare la cancellazione del suo importante contratto di consulenza e la freddezza di alcuni colleghi del California Institute of Technology. Il giorno dopo che Pauling e Corey presentarono i loro sette articoli sulle proteine per la pubblicazione, l’House Un-American Activities Committee nominò Pauling uno dei principali americani coinvolti in una “Campagna per disarmare e sconfiggere gli Stati Uniti” (8). Il comunicato stampa recitava: “Il suo intero curriculum… indica che il Dr. Linus Pauling è principalmente impegnato a mettere le sue conquiste scientifiche al servizio di una serie di organizzazioni che hanno in comune la loro completa sottomissione al Partito Comunista degli USA e all’Unione Sovietica”. In qualche modo, anche di fronte a tali false invettive e molteplici distrazioni, Pauling riusciva a mantenere la sua concentrazione di scienziato creativo di alto livello.

Riconoscimenti

Ringrazio David R. Davies, Richard E. Dickerson, Jack Dunitz, Richard E. Marsh, e Doug Rees per la discussione.

Punti di riferimento

  • ↵* E-mail: david{at}mbi.ucla.edu.

  • Questa prospettiva è pubblicata come parte di una serie che evidenzia articoli di riferimento pubblicati in PNAS. Leggi di più su questo classico articolo PNAS online su www.pnas.org/misc/classics.shtml.

  • ↵† Le lunghezze di legame sono tutte entro 1 deviazione standard di quelle determinate 40 anni dopo (15).

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