A descoberta da α-helix e da folha β, as principais características estruturais das proteínas

Abstract

PNAS papéis de Linus Pauling, Robert Corey, e Herman Branson na Primavera de 1951 propuseram a α-helix e a folha β, agora conhecida por formar a espinha dorsal de dezenas de milhares de proteínas. Eles deduziram estes blocos de construção fundamentais das propriedades de pequenas moléculas, conhecidas tanto das estruturas cristalinas como da teoria de ressonância da ligação química de Pauling que previam grupos de peptídeos planares. As tentativas anteriores de outros para construir modelos de hélices de proteínas tinham falhado, tanto ao incluir peptídeos não planares como ao insistir em hélices com um número integral de unidades por volta. Em aspectos importantes, os modelos Pauling-Corey-Branson foram surpreendentemente correctos, incluindo comprimentos de ligação que não foram ultrapassados em precisão durante >40 anos. No entanto, não consideraram a mão da hélice ou a possibilidade de folhas dobradas. Propuseram também estruturas e funções que não foram encontradas, incluindo a γ-helix.

Adecade antes de as estruturas de proteínas inteiras serem reveladas pela cristalografia de raios X, Linus Pauling e Robert Corey do Instituto de Tecnologia da Califórnia (Fig. 1) deduziram as duas principais características estruturais das proteínas: a α-helix e a folha β, agora conhecida por formar o backbones de dezenas de milhares de proteínas. As suas deduções, triunfos na construção de modelos de moléculas grandes baseados em características de moléculas mais pequenas, foram publicadas numa série de oito artigos, comunicados à PNAS em Fevereiro e Março de 1951. O seu trabalho teve um significado para as proteínas comparável ao do artigo Watson-Crick para o ADN, que adoptou a abordagem de construção de modelos Pauling-Corey. Aqui resumo os pontos principais destes artigos históricos, e depois menciono algumas omissões surpreendentes dos mesmos.

iv xmlns:xhtml=”http://www.w3.org/1999/xhtml Fig. 1.

Linus Pauling e Robert Corey (A) e Herman Branson (B). A profunda compreensão de Pauling sobre a estrutura química e a sua ligação, a sua memória retentiva para detalhes, e o seu talento criativo foram todos factores na descoberta da α-helix. Robert Corey era um cristógrafo digno e tímido de raios X com o know-how e paciência para trabalhar estruturas difíceis, fornecendo a Pauling a informação fundamental de que necessitava. Herman Branson era um físico de licença no Instituto de Tecnologia da Califórnia, que foi orientado por Pauling para encontrar todos os helices compatíveis com as regras da química estrutural que ele e Corey tinham determinado. A hélice de madeira entre Pauling e Corey tem uma escala de 1 polegada por Å, uma ampliação de 254.000.000 vezes. (A) Cortesia dos Arquivos, Instituto de Tecnologia da Califórnia. (B) Cortesia dos Arquivos da Universidade Lincoln da Pensilvânia.

O mais revolucionário destes artigos é o primeiro, submetido à PNAS no 50º aniversário da Pauling, 28 de Fevereiro de 1951. É A Estrutura das Proteínas: Duas Configurações Helicoidais Ligadas ao Hidrogénio da Cadeia de Polipéptidos (1), nas quais Pauling e Corey são unidos por um terceiro co-autor, H. R. Branson, um físico afro-americano, então de licença da sua posição de faculdade na Universidade de Howard (Fig. 1). No parágrafo inicial, os autores afirmam que “temos vindo a atacar o problema da estrutura das proteínas de várias maneiras. Uma destas formas é a determinação completa e precisa da estrutura cristalina de aminoácidos, peptídeos e outras substâncias simples relacionadas com proteínas, para que se possa obter informação sobre distâncias interatómicas, ângulos de ligação, e outros parâmetros configuracionais que permitam a previsão fiável de configurações razoáveis da cadeia de polipeptídeos”. Por outras palavras, o químico estrutural Pauling acreditava que com uma lista precisa de peças para as proteínas em mãos seria capaz de inferir aspectos importantes da sua arquitectura global, e isto provou ser assim.

Os dois parágrafos seguintes expõem concisamente o método: “O problema que nos colocámos é o de encontrar todas as estruturas ligadas a hidrogénio para uma única cadeia de polipeptídeos, em que os resíduos são equivalentes (excepto as diferenças na cadeia lateral R)”. Ou seja, os autores procuraram todas as estruturas repetitivas possíveis (helices) nas quais o carbonil CImagem integradaO grupo de cada resíduo de aminoácido aceita uma ligação de hidrogénio N-H a partir de outro resíduo. Porque acreditaram eles que haveria apenas um pequeno número de tipos de hélices? Isto deveu-se às limitações de estrutura impostas pelos ângulos de ligação de comprimentos precisos que tinham encontrado nos seus estudos anteriores de estruturas cristalinas de aminoácidos e peptídeos, os componentes a partir dos quais as proteínas são construídas. Estas restrições estão resumidas no terceiro parágrafo do seu artigo, que especifica a três números significativos os comprimentos e ângulos de ligação que tinham encontrado.† A restrição mais importante era que todos os seis átomos do grupo amida (ou peptídeo), que une cada resíduo de aminoácidos ao seguinte na cadeia proteica, se encontram num único plano. Pauling tinha previsto grupos peptídeos planares devido à ressonância dos electrões entre a ligação dupla do grupo carbonilo e a ligação amida C-N do grupo peptídeo (Esquema 1).

Esquema 1.

De facto, tais grupos de peptídeo planar tinham sido observados nas estruturas cristalinas de N-acetilglicina e β-glycylglycine. Como dizem os autores: “Esta característica estrutural foi verificada para cada uma das amidas que estudámos. Além disso, a teoria da ressonância está agora tão bem fundamentada e a sua fundamentação experimental tão extensa que não pode haver dúvidas sobre a sua aplicação ao grupo amida”

Quando Pauling, Corey, e Branson construíram helices com grupos amida planares, com as dimensões precisas de ligação que tinham observado nas estruturas cristalinas, e com ligações de hidrogénio lineares de comprimento 2,72 Å, descobriram que havia apenas duas possibilidades. Estas duas chamaram a hélice com 3,7 resíduos por volta e a hélice com 5,1 resíduos por volta (Fig. 2), que em breve será chamada de α-helix e γ-helix.

Fig. 2.

A hélice α-helix (Esquerda) e a hélice γ-helix (Direita), como descrito no jornal de 1951 por Pauling, Corey, e Branson (1). Os bioquímicos notarão que o CImagem EmbutidaO grupos do α-helix apontam na direcção do seu terminal C, enquanto que os do γ-helix apontam na direcção do seu terminal N, e, além disso, que o α-helix mostrado é canhoto e constituído por d-aminoácidos. (Reproduzido com permissão de Linda Pauling Kamb.)

p>Muito do resto deste breve e brilhante papel é retomado com uma comparação destes dois hélices com hélices propostos anteriormente por outros, mais notadamente Bragg, Kendrew, e Perutz (2) num papel no ano anterior, que tentou enumerar todos os hélices de proteínas possíveis, mas falhou estes dois. No seu artigo α-helix, Pauling et al. tomam um tom de triunfo: “Nenhum destes autores propõe a nossa hélice 3.7-residue ou a nossa hélice 5.1-residue. Por outro lado, eliminaríamos pelos nossos postulados básicos todas as estruturas propostas por eles. A razão para a diferença nos resultados obtidos por outros investigadores e por nós através de argumentos essencialmente semelhantes é que tanto Bragg como os seus colaboradores… discutiram em pormenor apenas estruturas helicoidais com um número integral de resíduos por volta, e além disso assumiram apenas uma aproximação grosseira aos requisitos sobre ângulos de ligação das distâncias interatómicas, e planaridade do grupo conjugado amida, como dado pelas nossas investigações de substâncias mais simples. Sustentamos que estas características estereoquímicas devem ser muito bem mantidas em configurações estáveis de cadeias de polipéptidos em proteínas, e que não há estabilidade especial associada a um número integral de resíduos por volta na molécula helicoidal”. Em suma, a estereoquímica é importante para determinar quais os hélices possíveis, e a simetria integral não tem qualquer papel.

Hoje em dia, aceitamos sem um segundo pensamento que os hélices não precisam de ter um número integral de unidades monómeras por volta. Mas em 1950, os fundos cristalo-gráficos de Bragg, Kendrew, e Perutz, três dos maiores cientistas de estruturas do século XX, impuseram-lhes a noção de número integral de unidades por unidade de célula. Também lhes escapava a necessidade de grupos de peptídeos planares. Trabalhando no departamento de física da Universidade de Cambridge (Cambridge, Reino Unido), desconheciam a conjugação com laços duplos nas proximidades. O professor de química orgânica em Cambridge nessa altura era Alexander Todd, que trabalhava no pátio de Bragg e da sua equipa. Todd recordou (3) que “apesar da proximidade, Bragg nunca, que eu saiba, pôs os pés no laboratório químico… até que um dia… veio ao meu quarto num estado de espírito algo agitado, tendo um monte de papéis na mão”, incluindo o papel Pauling-Corey-Branson e o seu próprio papel em helices. Bragg perguntou a Todd se preferia a hélice α em vez dos helices que Bragg e os seus colegas de trabalho tinham inventado. Todd respondeu: “Penso que, dadas as provas, qualquer químico orgânico aceitaria o ponto de vista de Pauling. De facto, se em qualquer altura desde que estive em Cambridge tivesse vindo ao laboratório químico, eu… ter-lhe-ia dito isso””

A ideia do não-integral α-helix tinha chegado a Pauling 3 anos antes, quando ele era professor visitante na Universidade de Oxford. Apanhou frio com o tempo húmido e passou vários dias na cama. Recordou (4) que logo se aborreceu com romances policiais e “Não tinha comigo nenhum modelo molecular em Oxford mas peguei numa folha de papel e esbocei os átomos com as ligações entre eles e depois dobrei o papel para dobrar uma ligação no ângulo certo, o que eu achava que devia ser relativo à outra, e continuei a fazer isto, fazendo uma hélice, até conseguir formar ligações de hidrogénio entre uma volta da hélice e a próxima volta da hélice, e demorou apenas algumas horas a fazer isso para descobrir a hélice α.”

Porquê o atraso de Pauling 3 anos na publicação desta descoberta que lhe chegou em apenas algumas horas? Ele deu a resposta no seu discurso de banquete no terceiro simpósio da Sociedade das Proteínas em Seattle, em 1989. Ficou inquieto que o padrão de difracção de α-keratin mostre como principal característica meridional uma forte reflexão na resolução de 5,15-Å, enquanto que a repetição de α-helix calculada a partir dos seus modelos com Corey estava em 5,4 Å. Como diz no seu quarto artigo da série PNAS com Corey: “O arco de 5,15-Å parece em primeira consideração para excluir o α-helix, para o qual o período c-eixo deve ser um múltiplo da distância do eixo por volta…”. Mas depois veio o papel em 1950 de Bragg, Kendrew, e Perutz, enumerando potenciais hélices proteicas. Pauling disse ao seu público em 1989: “Eu sabia que se eles conseguissem arranjar todos os hélices errados, em breve arranjariam o correcto, por isso senti a necessidade de o publicar”

A origem da discrepância entre a repetição da hélice α e o reflexo de raio-x de α-keratin foi atingida um ano mais tarde por Francis Crick (5), depois por um estudante de pós-graduação com Perutz, e também por Pauling. É que a queratina é uma bobina enrolada, com o α-helices a enrolarem-se à volta um do outro. A excursão mais ampla da α-helix na bobine reduz a sua distância de repetição para 5,1 Å. Este dom de saber qual o facto contraditório a ignorar foi uma das grandes capacidades de Pauling como cientista criativo.

The β-Sheets

O segundo artigo da série apareceu como um de um grupo de sete num único número da PNAS. Foi: The Pleated Sheet, A New Layer Configuration of Polypeptide Chains (6). Neste artigo, Pauling e Corey relatam que descobriram uma configuração de camadas de cadeias de polipeptídeos com ligação de hidrogénio, em que os grupos de peptídeos planares se encontram no plano da folha, e as sucessivas cadeias de proteínas podem correr em direcções opostas, dando uma folha antiparalela, bem como uma folha paralela. Em ambas, as ligações H lineares são novamente formadas, mas entre cadeias de proteínas, em vez de dentro de uma única cadeia. Isto resulta em cadeias proteicas que não são completamente estendidas: o aumento por resíduo é de 3,3 Å, um espaçamento visto em padrões de difracção de raios X de β-queratina, em vez de 3,6 Å, esperado para uma cadeia proteica completamente estendida.

Confirmação dos modelos α-Helical e β-Sheet

Confirmação da hélice α-helix veio de Max Perutz, um dos três autores do artigo de 1950 que tinha enumerado as hélices erradas. Numa manhã de sábado, na Primavera de 1951, deparou-se com o artigo PNAS (7). “Fiquei atordoado com o jornal de Pauling e Corey. Em contraste com o de Kendrew e os meus hélices, os seus eram livres de tensão; todos os grupos de amida eram planares e cada grupo carbonilo formava uma ligação de hidrogénio perfeita com um grupo imino quatro resíduos mais à frente ao longo da cadeia. A estrutura parecia morta. Como poderia ter falhado…. Voltei para casa para almoçar e comi-a sem saber da conversa dos meus filhos e sem responder às perguntas da minha mulher sobre o que se passava comigo hoje”

Suddenly Perutz teve uma ideia: “Pauling e Corey’s α-helix era como uma escada em espiral na qual os resíduos de aminoácidos formavam os degraus e a altura de cada degrau era 1.5 Å. De acordo com a teoria da difracção, esta repetição regular deveria dar origem a uma forte reflexão de raios X de 1,5 Å espaçamento dos planos perpendiculares ao eixo das fibras. Em excitação louca, voltei ao laboratório e procurei um pêlo de cavalo que tinha guardado numa gaveta…” e coloquei-o no feixe de raios X num ângulo de 31º com o feixe para levar a repetição de 1,5-Å para a posição de reflexão. “Após algumas horas, desenvolvi o filme, o meu coração na minha boca. Assim que acendi a luz, encontrei uma forte reflexão a 1,5-Å de espaçamento, exactamente como foi exigido por Pauling e Corey’s α-helix”

Na segunda-feira de manhã, Perutz mostrou a sua imagem de difracção de raios-x a Bragg. “Quando ele me perguntou o que me fez pensar nesta experiência crucial, eu disse-lhe que a ideia tinha sido desencadeada pela minha fúria por eu próprio ter perdido a construção daquela bela estrutura. A resposta rápida de Bragg foi: “Quem me dera ter-te irritado mais cedo!” porque a descoberta da reflexão de 1,5-Å ter-nos-ia levado directamente à hélice α”. Perutz também encontrou o reflexo de 1,5-Å na difracção da hemoglobina. Ele escreveu a Pauling (8), “O cumprimento desta previsão e, finalmente, a descoberta deste reflexo na hemoglobina tem sido a descoberta mais emocionante da minha vida”. Perutz, juntamente com os seus colegas de trabalho Dickerson, Kendrew, Strandberg, e Davies, iria fazer descobertas ainda mais emocionantes mais tarde, incluindo ver imagens directas de α-helices em mioglobina e hemoglobina.

β-Folhas e fitas simples β- foram vistas pela primeira vez em proteínas globulares como na estrutura da lisozima da clara do ovo em 1965 (9). Uma surpresa inicial foi que tanto os fios como as folhas são torcidos, ao contrário dos fios rectos e das folhas pregueadas de Pauling e Corey. Em 1989, Pauling recordou que assim que viu a estrutura da lisozima com a sua folha torcida, percebeu que deveria ter incorporado a torção no modelo original. Mais recentemente, houve análises minuciosas de torção e tosquia em β-estruturas (10, 11).

Algumas Omissões Surpreendentes dos Papers de 1951

Chemista que observem cuidadosamente a hélice α da Fig. 2 notarão duas características surpreendentes: (i) É uma hélice canhota, ao contrário de α-helices de proteínas biológicas, que são agora conhecidas por serem dextras. Ou seja, se o polegar esquerdo apontar ao longo do eixo da hélice, a hélice gira na direcção dos dedos da mão esquerda. (ii) A configuração dos grupos químicos à volta de cada átomo de carbono α tem a configuração d, em vez da configuração l naturalmente ocorrida dos resíduos de aminoácidos nas proteínas. Ou seja, este modelo de Pauling et al. é a imagem de espelho de uma hélice α numa proteína natural. Em contraste, a hélice γ-helix da Fig. 2 é uma hélice de direita composta por resíduos de d-aminoácidos. Porque é que os autores escolheram a hélice α-helix como canhoto, com d-aminoácidos?

A base desta escolha foi recentemente analisada por Dunitz (12), que tinha sido pós-doutorada no Instituto de Tecnologia da Califórnia na altura da pesquisa Pauling-Corey. De facto, foi Dunitz que persuadiu Pauling a mudar a sua terminologia de “espiral” para “hélice” na descrição das novas estruturas proteicas. Na sua análise, Dunitz observa que 1951, o ano da hélice α, foi também o ano em que J. M. Bijvoet estabeleceu a configuração absoluta das moléculas através da dispersão anómala dos raios X. Após ter recordado as discussões de mão de obra no Instituto de Tecnologia da Califórnia, nesse ano, Dunitz conclui: “Ou Pauling não tinha conhecimento destes desenvolvimentos quando escreveu o documento α-helix, ou sabia sobre eles mas não estava interessado… Tenho tendência a acreditar que quando escreveram o papel, ou muito possivelmente até quando fizeram os modelos, Pauling (ou o seu colega Robert B. Corey) simplesmente escolheu uma das duas configurações de aminoácidos (como aconteceu, a errada) para ilustrar as estruturas helicoidais e não deu muita importância ao problema da configuração absoluta… Os problemas de configuração absoluta receberam pouca ou nenhuma atenção, porque parecia não haver necessidade deles na altura. Talvez até tenham sido considerados como uma distracção da tarefa em mãos. Por vezes é possível focar mais claramente fechando um olho”

Tambem faltando no primeiro trabalho é algo mais do que uma breve menção à hélice 310, um componente das proteínas globulares raramente encontrado em segmentos curtos, mas mais comum do que a hélice Pauling-Corey-Branson γ-helix, que praticamente nunca é vista. As ligações H da hélice 310 são demasiado longas e dobradas para terem sido aceitáveis pelos rigorosos limiares estabelecidos pelos autores. A sua intuição sobre as estruturas desestabilizadoras das ligações de hidrogénio dobradas e longas foi basicamente correcta, mas os limiares que fixaram são mais rigorosos do que os utilizados actualmente (13), agora que sabemos que a natureza aceita a hélice 310.

p> Uma outra omissão do conjunto de artigos de 1951 é o diagrama Ramachandran. Este é um gráfico 2D dos valores de rotação permitidos sobre a N-Cα e Cα-CEmbedded ImageO bonds in the protein backbone, introduzido por Ramachandran e outros em 1964 (14). Este diagrama mostra que a maioria dos valores de rotação sobre estas duas ligações são proibidos por colisões de átomos protéicos. Apenas duas grandes regiões do diagrama são permitidas: uma corresponde à hélice α, e outra às cadeias quase estendidas das folhas de β. Actualmente, o diagrama Ramachandran é ensinado em todas as aulas sobre a estrutura das proteínas e é apresentado em todos os manuais escolares para dar uma visão das forças que determinam as estruturas das proteínas. Mas não há nada neste diagrama para além do que Pauling e Corey sabiam bem: construíram modelos das suas estruturas propostas que incorporavam todas as características do diagrama Ramachandran. Aparentemente, compreenderam os princípios tão bem que não sentiram necessidade de os explicar através de um diagrama deste tipo. Outro factor pode ter sido o facto de Pauling e Corey se terem concentrado mais na estabilidade proporcionada pelas ligações de hidrogénio e menos nas restrições a possíveis estruturas ditadas por colisões entre átomos não ligados.

Os Outros Seis Artigos PNAS de Pauling e Corey e o Contexto Mais Amplo

Os restantes seis artigos em PNAS dão as coordenadas atómicas dos modelos e interpretam os padrões de difracção das proteínas fibrosas em termos dos modelos. Há muito nestes artigos do que não foi confirmado, incluindo uma proposta de que a contracção muscular é uma transição de cordões alargados β para cordões compactos α-helices. No entanto, a correcção de cortar a respiração das folhas α-helix e β e a abordagem arrojada de modelação de estruturas biológicas a partir de princípios químicos ofuscam o resto.

Estes trabalhos são ainda mais notáveis quando consideramos o contexto político em que foram escritos. Durante este período, Pauling esteve também fortemente envolvido na defesa de académicos, incluindo ele próprio, contra acusações de deslealdade para com os Estados Unidos, provocadas pelas pressões da Guerra Fria e do que ficou conhecido como McCarthyism. Foi intimado a comparecer perante vários comités de investigação anticomunistas, recebeu correio de ódio pelo seu trabalho sobre causas liberais, e enfrentou o cancelamento do seu importante contrato de consultoria e frieza de alguns colegas do Instituto de Tecnologia da Califórnia. No dia seguinte a Pauling e Corey terem submetido os seus sete trabalhos sobre proteínas para publicação, o Comité de Actividades Unamericanas da Câmara nomeou Pauling como um dos principais americanos envolvidos numa “Campanha para Desarmar e Derrotar os Estados Unidos” (8). O comunicado de imprensa dizia: “Todo o seu registo… indica que o Dr. Linus Pauling está principalmente empenhado em colocar os seus feitos científicos ao serviço de uma série de organizações que têm em comum a sua completa subserviência ao Partido Comunista dos EUA, e à União Soviética”. De alguma forma, mesmo face a tais falsas distracções invectivas e múltiplas, Pauling poderia manter o seu foco como um cientista criativo de topo.

Agradecimentos

Eu agradeço a David R. Davies, Richard E. Dickerson, Jack Dunitz, Richard E. Marsh, e Doug Rees para discussão.

Footnotes

  • ↵* E-mail: david{at}mbi.ucla.edu.

  • Esta perspectiva é publicada como parte de uma série que destaca artigos de referência publicados no PNAS. Leia mais sobre este artigo clássico do PNAS online em www.pnas.org/misc/classics.shtml.

  • ↵† Os comprimentos das obrigações estão todos dentro de 1 desvio padrão daqueles determinados 40 anos depois (15).

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